一、乙型肝炎病毒耐藥基因檢測的臨床意義

　　WHO相關資料顯示，全球感染過乙型肝炎（病毒HBV）的患者超過三分之一，而慢性乙型肝炎患者約有2.4億，乙肝嚴重影響著人類的生命健康。HBV是傳染性疾病乙型病毒性肝炎的主要病因，感染HBV可引起肝硬化甚至肝細胞癌變。HBV屬嗜肝DNA病毒科，為雙鏈DNA病毒，容易發生變異，從而形成不同的基因型。目前已根據HBV核苷酸序列異質性≥8%將其分成A-J 10種基因型[1-2]。在我國北方以C型為主，南方以B型為主，新疆有出現D型。作為常規抗病毒治療的核苷（酸）類似藥物，拉米夫定(LAM)和阿德福韋酯(ADV)等能夠有效抑制HBV的復制，然而長期使用會導致耐藥的發生，使治療效果明顯下降。隨著分子生物學的快速發展，越來越多的分子生物學技術用于HBV的基因分析，從而為乙肝患者的抗病毒治療提供科學的依據。盡早檢測HBV變異，準確判斷拉米夫定和阿德福韋酯等治療后耐藥，指導個性化用藥，對于提高乙肝治療成功率具有很重要的價值。

　　二、乙型肝炎病毒耐藥機制以及常見的突變基因位點

　　HBV基因型耐藥是指乙肝病毒出現某種特定的突變，這些特定的突變點導致HBV耐藥。其分子機制是：HBV是一種變異較高的病毒，在復制過程必須經過RNA中間體的逆轉錄復制步驟，但RNA聚合酶和逆轉錄酶缺乏校正功能，因此在宿主免疫壓力和抗病毒藥物的選擇壓力下，其核酸在少數位點上發生突變是一種常見現象。

　　HBV對核苷（酸）類似物耐藥的產生與HBV聚合酶基因變異有關，并且HBV聚合酶基因變異是多位點的，以C區YMDD（酪氨酸－蛋氨酸－天冬氨酸－天冬氨酸）基序的變異最為重要。拉米夫定(LAM)的主要耐藥位點位于C區（rtM204V/I），204位點的蛋氨酸被纈氨酸（V）或異亮氨酸（I）置換，即rtM204V/I。上述突變直接導致病毒對藥物的敏感性降低，被稱為原發耐藥突變。另外部分突變不直接引起病毒對藥物敏感性的下降，但可以恢復原發耐藥變異病毒受損的復制力，被稱為補償耐藥突變，主要有rtV173L、rtL180M(常與rtM204V共同出現)和rtL80I(常與rtM204I共同出現)[3]。比如，HBV雙點突變株如rtM204V/rtL180M，其病毒復制能力強于rtM204I的單點突變株，可能與rtL180M（B區）的變異補償C區YMDD變異株的復制缺陷有關。而另一種代表藥物阿德福韋酯(ADV)，其耐藥變異位點則主要集中于HBV聚合酶基因B區rtA181T和D區rtN236T位點。

　　三、乙型肝炎病毒耐藥基因檢測方法

　　1.PCR產物直接測序：是將HBV基因組的逆轉錄酶區進行擴增后直接進行測序分析的方法。PCR產物直接測序法可檢測已知和可能的未知耐藥變異位點，是最常用的基因型耐藥檢測方法之一。PCR產物直接測序的方法一般作為基因型耐藥檢測的金標準。該方法的缺點是靈敏性較差，只有當變異株超過HBV準種池的20%時才能被發現。

　　2.聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)：該方法具有較強的靈敏性，可檢測數量占HBV準種池5%的耐藥變異株。但是PCR-RFLP只能檢測已知、單一位點的變異，對于少數耐藥變異位點監測不失為一種簡便、快速且廉價的方法。但隨著多種核苷（酸）類似物的相繼問世和HBV耐藥變異位點的不斷出現，該方法將難以勝任多位點變異的檢測。

　　3.反向雜交法：基于該技術的INNO-LiPA方法在國外已獲準應用于臨床檢測，目前INNO-LiPA HBV DR v3 可檢測包括拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、恩替卡韋(ETV)與阿德福韋酯(ADV)常見耐藥位點。該法可檢測變異株占HBV準種池5% ~ 10%的樣品，故敏感性較好，但其同樣只能檢測已知位點變異。

　　4.實時熒光PCR：該方法操作簡便，可檢測變異發生率低于10%的耐藥變異。僅能檢測已知位點。

　　5.基因芯片：亦稱DNA芯片、DNA微陣列，可檢測已知變異位點。

　　6.限制性片段質譜多態性技術：該技術是將PCR-RFLP技術與基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術結合，靈敏度高，能夠發現數量不足HBV準種池1%的變異株，但其同樣僅能檢測已知位點變異，且價格昂貴，很難在臨床推廣應用。

　　四、目前已上市產品介紹

　　我國已批準上市的乙型肝炎病毒耐藥基因檢測試劑盒較多采用熒光PCR法，主要為國產產品，針對的基因突變位點主要是204位點的YMDD→YIDD（550ATG→ATT及550ATG→ATC）與YMDD→YVDD（550ATG→GTG）。還有較少產品能夠檢測發生在180位點（rtL180M）的基因突變。

　　五、小結

　　由于肝細胞中的共價環狀閉合DNA持續存在，使得乙肝患者需要長期用藥治療。抗HBV核苷（酸）類藥物主要有拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、恩替卡韋(ETV)、阿德福韋酯(ADV)和富馬酸替諾福韋酯(TDF)，其中前4種已在我國上市。長期使用核苷（酸）類似藥物不可避免地導致耐藥基因突變，最終病毒恢復復制能力，病情反彈。盡早進行乙肝病毒耐藥基因突變的檢測，可以及時發現病毒的耐藥情況，指導醫生合理用藥。隨著生物檢測技術的發展，越來越多的突變位點被發現，為此類產品的技術審評帶來挑戰。