一、方法驗證的趨勢

WHO、FDA、USP 和ISO 17025 對于分析方法驗證的定義和解釋基本一致，其核心是實驗室通過試驗設(shè)計和測試，證明被驗證的方法適用于該方法擬定的檢測用途。分析方法要求具有專屬、準(zhǔn)確、耐用、重現(xiàn)性好的特點，不同的實驗室對方法驗證的具體做法和可接受標(biāo)準(zhǔn)往往是不同的，但是，基本都會根據(jù)官方指導(dǎo)原則或藥典通則規(guī)定進行方法學(xué)驗證，并符合GMP要求。

不同國際組織和藥典要求的方法學(xué)驗證參數(shù)

需要注意的是，2015版中國藥典通則9101《藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則》中增加了“校正因子”的驗證，詳見下表。

ChP2015檢驗項目和驗證指標(biāo)

CDE電子刊物《HPLC法校正因子研究中的幾個問題》一文記載，在一般情況下，校正因子可視具體情況通過如下幾種方法測定：

（1）單濃度點測定

（2）多濃度點測定

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定

（4）吸收系數(shù)比值法

其中，（1）和（2）法較為簡捷，可以快捷地量化特定雜質(zhì)與主成分紫外吸收特征的差異，多用于評估采用主成分自身對照法定量雜質(zhì)時是否需要校正。但如采用加校正因子的主成分自身對照法定量雜質(zhì)，需將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)賦值信息轉(zhuǎn)化為校正因子固化在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，那么校正因子的準(zhǔn)確性非常關(guān)鍵，校正因子的準(zhǔn)確計算應(yīng)符合更為嚴(yán)格的要求，需要考慮并控制求算校正因子過程中的各種誤差因素，以及儀器通用性和色譜系統(tǒng)的耐用性等因素，以便使求得的常數(shù)更為準(zhǔn)確并具代表性，此時采用（3）、（4）法更為適宜，如能考慮到測定人員、不同試驗室因素的影響，會更加符合常數(shù)求算的基本要求。

通過上述介紹不難發(fā)現(xiàn)，方法學(xué)驗證不僅僅是完成某個指標(biāo)（如回收率、重復(fù)性）的驗證。指導(dǎo)原則或藥典沒有規(guī)定每個具體驗證指標(biāo)的試驗方法，原料藥、制劑、劑型、正相色譜、反相色譜、甚至不同公司SOP規(guī)定的不同都會引起結(jié)果的差異和準(zhǔn)確性。例如回收率，有時會出現(xiàn)由于實驗設(shè)計方法不同、對指導(dǎo)原則或藥典理解的不同而產(chǎn)生不同的試驗結(jié)果，或符合要求，或不符合要求，而究竟哪個是“科學(xué)合理”的，仁者見仁智者見智。

實驗設(shè)計（方案）的多樣性、對樣品從取樣到檢測完畢這個過程的研究深度、是否對檢測過程中的“異常”問題進行深入分析等，往往會對最終測定結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響甚至?xí)率?ldquo;超標(biāo)”現(xiàn)象。例如：文章《辛伐他汀片的含量測定中研磨對含量結(jié)果的影響》報道，日常檢驗中發(fā)現(xiàn)辛伐他汀片同一批成品的含量與同批顆粒的含量偏低4%左右。從顆粒到壓片的過程，從理論上講不應(yīng)該出現(xiàn)主藥含量下降的情況，并且檢驗過程無誤。由于在檢驗過程中顆粒和成品的區(qū)別只有研磨時間和難易程度不同，所以從研磨方面查找原因。結(jié)果表明，辛伐他汀片在含量測定過程中，取20片研磨稱取細(xì)粉測定含量的結(jié)果與不研磨而是直接稱取整片測定含量的結(jié)果比較相差較大。研究發(fā)現(xiàn)研磨程度和研缽大小都會有一定影響，所以應(yīng)取用相同材質(zhì)和同樣大小的研缽，并且用力均一。研磨樣品應(yīng)都取20 片，防止樣品的研磨量不同引起誤差。5mg規(guī)格辛伐他汀片應(yīng)直接稱取4 片進行測定。部分代表性數(shù)據(jù)如下：

所以，在方法建立和方法驗證階段，采用簡單、傳統(tǒng)的研究思路和實驗設(shè)計可能不能保證日后的測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和使用目的，我們需要在做驗證時考慮更加細(xì)致，通過大量的比較研究、科學(xué)地去設(shè)計方案、模擬實際情況，開展方法驗證。

2016年10月14日，USP發(fā)布了一個新的通則“分析方法生命周期” The Analytical Procedure Lifecycle <1220>征求意見稿，并發(fā)表在美國藥典論壇43（1）【2017年1-2月】上。其中的理念與ICH Q8、Q9、Q10和Q11所述的質(zhì)量源于設(shè)計的理念一致。這是一個新的方法驗證思路，值得我們學(xué)習(xí)和借鑒。

例如在USP <1220>中規(guī)定，將分析方法的整個生命周期劃分為三個階段。

Stage1: Procedure Design and Development (Knowledge Gathering, Risk Assessment, Analytical Control Strategy, Knowledge Management, Preparing for Qualification)

第1段：方法設(shè)計和開發(fā)（知識收集、風(fēng)險評估、分析控制策略、知識管理、確認(rèn)準(zhǔn)備）

Stage2: Procedure Performance Qualification

第2段：分析方法性能確認(rèn)

Stage3: Continued Procedure Performance Verification (Routine Monitoring, Changes to an Analytical Procedure) 

第3段：持續(xù)方法性能確認(rèn)（日常監(jiān)測，分析方法變更）

分析方法生命周期中的一個基本要素是制訂一個目標(biāo)說明對分析方法的性能要求。這些在分析目標(biāo)概況（ATP）中描述的要求可以看作是類似于產(chǎn)品質(zhì)量目標(biāo)要求（QTPP）。在ATP中，我們需要研究和控制各種不確定度，研究可能產(chǎn)生偏差（如專屬性、線性、提取回收率、濾膜驗證、檢測波長、溶液穩(wěn)定性、分析物的溶解度）和提高方法精密度的因素（如樣品制備過程、稱量、儀器、積分、背景噪音、重復(fù)次數(shù)、操作人員）。

如果采用新的研究思路，會要求應(yīng)用新的實驗設(shè)計。如文獻《基于Q2（R1）理念的藥品質(zhì)量分析方法驗證新概念》報道，在進行線性試驗時，可根據(jù)ICH要求, 配制5種濃度水平來評估，根據(jù)eNvoal的要求, 至少需要獨立的3個序列, 且每個序列至少重復(fù)3次，實驗設(shè)計如下表所示。

實驗設(shè)計要求目標(biāo)

在整個實驗過程中, 范圍、準(zhǔn)確度、精密度、線性和定量限被涵蓋, 其中準(zhǔn)確度和精密度能夠通過eNvoal軟件一次性評估。為了得到在一定置信區(qū)間內(nèi)各個濃度水平某個單個測試結(jié)果的預(yù)測區(qū)間，需要通過專業(yè)的統(tǒng)計軟件來完成。

通過eNvoal引入了準(zhǔn)確性特征值的概念，是整個濃度范圍的預(yù)測模式, 涵蓋了準(zhǔn)確性、準(zhǔn)確性、精密度和定量限。推斷預(yù)測區(qū)間和風(fēng)險評估, 也可提供一般統(tǒng)計數(shù)據(jù)(平均值、RSD等)。濃度范圍的預(yù)測的準(zhǔn)確性和特征值，見下圖。

濃度范圍預(yù)測的準(zhǔn)確性和特征值曲線圖

通過eNvoal能夠非常容易判斷出來該分析方法是否適用于檢測的要求。eNvoal結(jié)果判斷見下圖。

eNvoal結(jié)果判斷方法的有效性示意圖

eNvoal結(jié)果判斷方法的無效性示意圖

以上例子說明，與傳統(tǒng)的驗證方法相比，新的驗證方法實驗設(shè)計更加統(tǒng)一，驗證后的方法更加可信，是方法驗證的新趨勢。

二、方法驗證時需要注意的因素

對于一個分析方法需要考慮三方面因素，Sample Preparation、Measurement、Replicate Strategy。

在樣品的制備環(huán)節(jié)，一般包括稱量、提取、稀釋等環(huán)節(jié)，但是取樣的代表性有時也影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，這種影響是不能忽視的，例如出現(xiàn)制劑成品含量合格，中間產(chǎn)品含量不合格的情況往往是由于取樣過程中的問題引起的，在研究時應(yīng)將這個環(huán)節(jié)進行詳細(xì)分解研究。在溶液制備的過程中有兩個因素很關(guān)鍵，一個是樣品溶解/提取/溶出的是否完全，另一個是溶液的穩(wěn)定性。為了保證待測成分提取完全/不被破壞，就要考慮加入的藥物的量、是否存在靜電吸附、溶劑體積、提取方式，提取時間、提取溫度、是否避光操作等因素。

在測量這個環(huán)節(jié)，以HPLC為例，受到樣品溶液、對照品溶液、儀器性能、檢測器類型或能量、檢測波長、檢測器的參數(shù)設(shè)置、計算公式、線性范圍、溶劑峰（或輔料峰）、試劑純度、色譜柱、甚至樣品小瓶等的影響，總之變量因素非常多，遇到異常問題時可以采用魚骨圖等方式進行分解研究，如下圖。

方法的重現(xiàn)性控制策略在方法的建立、優(yōu)化、驗證時就應(yīng)該重要考慮，比如供試品溶液的制備方法的重現(xiàn)性、雜質(zhì)峰相對保留時間的重現(xiàn)性、雜質(zhì)校正因子的重現(xiàn)性、主峰保留時間的重現(xiàn)性、雜質(zhì)間分離度的重現(xiàn)性，這些項目中的影響因素需要考慮。例如樣品溶液是否受量瓶體積的影響、加入溶劑量的影響、取樣量的影響；保留時間是否受到不同色譜柱的影響、相同色譜柱不同粒徑或不同品牌的的影響等；分離度是否受到流速、柱溫、儀器死體積的影響等。

圍繞上述三個環(huán)節(jié)，列舉幾個方法驗證中有時需要注意的因素：

1、是否有一個溝通良好的項目討論小組。例如小組成員可包括合成、分析、制劑等。合成人員負(fù)責(zé)雜質(zhì)譜的分析、雜質(zhì)制備、結(jié)構(gòu)確證、譜圖解析、包裝等；分析人員負(fù)責(zé)方法摸索、驗證、雜質(zhì)標(biāo)定、雜質(zhì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立等；制劑人員負(fù)責(zé)提供空白輔料、相容性信息、制劑樣品。大家的目的是相同的，即保證方法驗證及其相關(guān)工作順利進行，對于雜質(zhì)譜分析和雜志控制策略往往需要大家一起討論制定。

2、明確分析方法的使用目的和應(yīng)用范圍。方法是用于測定什么的？是測定含量、雜質(zhì)、溶出度的還是做鑒別的，也就是說定量和定性的，目的不同，驗證的內(nèi)容也就不同。

3、明確樣品類型、方法類型。樣品是起始物料、中間體、反應(yīng)液、原料藥、還是制劑？例如對于原料和制劑來講，二者對方法的影響是不一樣的，制劑中的輔料常常會對方法造成干擾，如出現(xiàn)輔料峰、輔料引入的雜質(zhì)峰，還要考慮輔料對主藥的影響，以及溶劑提取、供試品溶液的制備方法是否合適。對于中間體、反應(yīng)液等有時可能不需要準(zhǔn)確定量、精密稱取。預(yù)計使用的雜質(zhì)計算方法是外標(biāo)法、自身對照法、還是歸一化法？

4、開展預(yù)驗證試驗和研究。在研究開始時分析儀器應(yīng)經(jīng)過DQ、IQ、OQ、PQ的確認(rèn)，如對于HPLC，UV、溶出度儀進行校驗，這是方法學(xué)驗證的基礎(chǔ)（如下圖所示）。每次分析前進行系統(tǒng)適用性試驗，保證系統(tǒng)性能符合要求。

要考察對照品溶液、供試品溶液、溶劑、流動相等的穩(wěn)定性情況，一般要求至少24h穩(wěn)定，找到敏感因素，并控制這些因素，如溫度、光等。確定系統(tǒng)適用性的評價方式和指標(biāo)，如采用峰鑒別對照品溶液、破壞溶液、還是對照品混合溶液？采用分離度、相對保留時間、主峰保留時間、理論板數(shù)、拖尾因子，還是RSD進行評價？要通過專屬性、降解試驗（或混合降解溶液）等評價色譜柱，確定廠家、品牌、固定相種類等。基線波動、漂移、出現(xiàn)鬼峰等是梯度洗脫中常見的問題，導(dǎo)致在扣除溶劑峰時遇到問題。這時可以從試劑純度、流動相使用時間、平衡時間、雜質(zhì)捕集柱等方面考慮。如使用高純度的試劑、水，帶有緩沖鹽的流動相現(xiàn)配現(xiàn)用，不超過48h內(nèi)使用；梯度洗脫后要摸索平衡時間，選擇一個合適的時間如5、10min等。當(dāng)遇到鬼峰很多的情況，可以使用流動相雜質(zhì)捕集小柱，如月旭科技Ghost-Buster Column流動相雜質(zhì)捕集小柱安裝在梯度混合器和進樣器之間，不僅能夠去除流動相中的雜質(zhì)，還可以有效去除管路和混合器中的雜質(zhì)。下圖為不加 Ghost-Buster流動相雜質(zhì)捕集柱(a)和加Ghost-Buster流動相雜質(zhì)捕集柱(b)對比色譜圖。

對于HPLC法的LOD和LOQ，有時受色譜圖的形狀影響很大，需要注意色譜柱的品牌和柱效，如下圖所示。有些方法參數(shù)的研究可以嘗試使用實驗設(shè)計（DOE）進行研究。

5、預(yù)驗證結(jié)束后可以起草一個方法的SOP和藥典格式的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案，并起草方法學(xué)驗證方案，盡可能詳細(xì)的列出操作步驟，便于操作和重復(fù)，列出各項驗證指標(biāo)可接受的范圍。例如列出色譜柱的詳細(xì)信息、樣品信息、對照品信息、儀器信息、溶劑配制詳細(xì)步驟和過程、所用試劑的級別和廠家、過濾器的類型和大小等、進樣順序表等，試驗中應(yīng)嚴(yán)格遵守SOP規(guī)定。

6、方法驗證結(jié)束后要及時匯總結(jié)果，整理驗證報告，并經(jīng)過復(fù)核和審核，將驗證報告和記錄等存檔。但是，驗證通過往往不代表后期檢驗樣品時沒有問題，仍需要對方法進行持續(xù)跟蹤、完善，關(guān)注樣品檢測時遇到的新的問題，有時可能需要對方法進行補充研究，進行追加驗證或再驗證。

綜上所述，藥品檢驗的分析方法來源于合理的設(shè)計，要保證操作過程嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)。USP<1220>、2015年版的《FDA分析方法驗證指南》、美國藥典論壇中的文章如Analytical Target Profile: Structure and Application throughout the Analytical Lifecycle、Analytical Control Strategy、Lifecycle Management of Analytical Procedures: Method Development, Procedure Performance Qualification, and Procedure Performance Verification、Fitness for Use: Decision Rules and Target Measurement Uncertainty等文章對于方法建立、驗證、管理具有一定的指導(dǎo)意義。質(zhì)量研究人員可借鑒其中的思想，領(lǐng)會新的驗證思路，同時在觀察到異常現(xiàn)象后，主動查找原因，找到問題的解決辦法，可對方法的控制策略有深刻的理解。

三、參考文獻

1、分析方法驗證、轉(zhuǎn)移和確認(rèn)概念分析

2、CDE電子刊物《HPLC法校正因子研究中的幾個問題》

3、辛伐他汀片的含量測定匯總研磨對含量結(jié)果的影響

4、基于Q2（R1）理念的藥品質(zhì)量分析方法驗證新概念

5、USP<1220> : The Analytical Procedure Lifecycle

6、USPPF: Analytical Control Strategy