色譜工作者常會碰到這樣的問題，什么時候該換色譜柱了?

塔板數是一個粗略的指標，不能作為評價色譜柱的標準。

通常使用塔板數來考察色譜系統：將新柱子接到儀器上，根據色譜柱生產商提供的測試條件測試該色譜柱，你應該得到和分析報告上同樣的結果。最差也應該得到比報告值低10%的塔板數。如果你所測得的塔板數遠遠低于廠家提供的報告數據，這就說明你的色譜系統可能存在一些問題。進樣器、柱外效應、毛細連接以及檢測器都是容易出現問題的地方。
 

相信每個色譜工作者都會關心分辨率，分辨率是考察一根色譜柱分離具體樣品的好壞程度的指標。色譜的核心任務就是為了使每個峰完成分離，我們在實際工作中需要得到合理峰寬的窄峰以便獲得較低的檢測限(這已經不是什么難題，現在的色譜柱都可以達到這個要求)。
 

然而，我們需要考慮的另一個因素是塔板數對分辨率的影響僅僅是平方根的關系，這意味著當一根色譜柱的塔板數下降50%，分辨率僅僅下降7%。而當一根色譜柱塔板數下降為新柱子一半的時候，你肯定看到了其它更加嚴重的癥狀告訴你這根色譜柱的壽命不長了。其實，大多數用戶僅僅使用色譜柱塔板數的一小部分。例如，對一支新的150mm×4.6mm，5mm粒徑的色譜柱來講，廠家測試報告上的塔板數為14,000。使用下面的公式可以估算一支色譜柱的塔板數：
 

N=3000*L/Dp
 

L是色譜柱的柱長，以厘米為單位;Dp是填料的粒徑，以微米為單位
 

一支150mm×4.6mm，5mm粒徑的色譜柱的柱效大約為9000，比廠家測試數據低30%。在實際的工作中，大多數色譜方法僅僅需要這些塔板數的一半，這些色譜方法還有優化的空間嗎?答案是肯定的。可見，色譜柱的塔板數不是分離中最重要的參數。
 

較好的方法是使用壓力、分辨率和峰形的混合指標來考察一根色譜柱的狀態。壓力的測量是最容易的，通常我們確定的色譜方法要滿足以下的要求：用新柱子時柱壓不高于2500psi，在任何情況下壓力都不超過3000psi。盡管現代的液相色譜系統都可在更高的壓力下使用，但由于高壓產生的系統損耗和泄漏的問題會很嚴重。當壓力超過3000psi時，考慮更換進樣器和色譜柱之間的0.5mm孔徑的在線濾片。如果更換濾片后壓力仍然高，則色譜柱的濾片或者是色譜柱已經被污染，這提示我們該換柱子了。有統計表明，超過60%的色譜柱損壞是由于壓力過高的原因。
 

分辨率是我們考察色譜柱的一個非常重要的指標，只要兩個組分可以獲得基線分離，對該分析物的定量就不會有什么問題。對于對稱的高斯峰來講，1.5的分辨率即可得到基線分離;若Rs在1.7至2.0之間則更好。若峰拖尾嚴重則需要更高的分辨率。使用分辨率作為色譜柱的評價指標的好處在于我們可以直觀地看到相鄰的峰的分離情況。
 

另外一個考察色譜柱質量的標準是峰形拖尾情況，廠家測試報告的峰形都非常漂亮，但這并不代表該色譜柱分析實際樣品的情況。實際樣品中總是含有或多或少引起峰形拖尾的組分。最值得一提的是含有氮原子的化合物，這些化合物和硅膠骨架上的游離硅羥基結合非常緊密，隨著色譜柱使用時間越長，鍵合相流失，拖尾則更加嚴重。然而拖尾情況的改變不像分辨率的改變那樣能夠馬上看出來。基于此，最好定一個拖尾因子的上限，如美國藥典規定拖尾因子不超過1.8。
 

確定色譜柱“拋棄”標準的最佳時間是當我們開發分析方法或作方法認證的時候。通常，在開發分析方法的過程中你會試驗幾根色譜柱，分析足夠多的實際樣品，你知道當分離變差的時候是什么樣的情況。我傾向于在開始時使用一個寬的范圍。我們的經驗是這樣的：你如果在開始時緊縮系統適用性要求，在方法認證后再放寬這個要求是很困難的。在分析實際樣品之前進行系統適用性考察，以確保該色譜方法滿足分析者可以接受的標準。

色譜柱使用前的注意事項

色譜柱在使用前，最好進行柱的性能測試，并將結果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。

但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是最佳條件)，只有這樣，測得的結果才有可比性。

樣品的前處理

a、最好使用流動相溶解樣品。

b、使用予處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產生不可逆吸附的雜質。

c、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質。

流動相的配制

液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：

a、流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。

b、流動相具有一定惰性，與樣品不產生化學反應(特殊情況除外)。

c、流動相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果；同時降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。

d、流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。

e、流動相沸點不要太低，否則容易產生氣泡，導致實驗無法進行。

f、在流動相配制好后，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發生作用。

流動相流速的選擇

因柱效是柱中流動相線性流速的函數，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對內徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對于內徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。

當選用最佳流速時，分析時間可能延長。可采用改變流動相的洗滌強度的方法以縮短分析時間(如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量)。

注意：

1．由于甲醇廉價，對于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場合除外)。

2．對于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動相，沒有提純的己烷不得使用。用水最好使用超純水(電阻率大于18兆歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質，有可能影響分析結果。

3．含水流動相最*在實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜。最好加入疊氮化鈉，防止細菌生長。

4．流動相要求使用0.45 μm濾膜過濾，除去微粒雜質。

5．使用HPLC級溶劑配制流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。