一、范圍

本標準規定了實驗室對微生物檢測方法進行方法確認和方法驗證的一般性原則。本標準適用于實驗室對非標準方法、實驗室制定的方法，超出其預定范圍使用的標準方法、擴充和修改過的標準方法的方法確認，以及實驗室對新引入標準方法正式使用前的方法驗證。

二、方法確認要求

（一）總則

實驗室應對非標準方法、實驗室制定的方法、超出預定范圍使用的標準方法、擴充和修改過的標準方法的確認制定程序。確認應盡可能全面，以滿足預期用途或應用領域的需要。對于確定過的方法，實驗室應制定作業指導書。實驗室應按照技術方案先進行實驗室內確認研究試驗，然后，由協作實驗室用相同的樣品進行實驗室間協同試驗。可采用對待確認方法與基準方法進行比較研究的方式，對待確認方法的性能參數進行確認。

（二）確認方法的特性參數

實驗室可在綜合考慮成本、風險和技術可行性基礎上，并根據預期的用途來進行方法確認。實驗室進行方法確認的內容應完整，包括但不限于以下方法特性：

方法的適用范圍；

檢測水平和/或定量限；

精密度（重復性和/或再現性）；

正確度；

準確度；

靈敏度；

包容性和排他性；

結果的測量不確定度。

確認方法特性參數的選擇

方法確認首先應明確檢測對象特定的需求，包括樣品的特征，數量等，并應滿足客戶的特殊需要，同時應根據方法的預期用途，選擇需要確認的方法特性參數，典型的需要確認的方法特性參數見表1。

表1 典型方法確認參數的選擇

（三）方法特性參數的確認

實驗室內方法特性參數的確認

靈敏度

靈敏度是基準方法或待確認方法從含有眾多微生物的樣本中檢測到目標微生物的能力，目的是確定基準方法和待確認方法之間的靈敏度差異。靈敏度試驗的樣品選擇自然和/或人為污染的樣品。每個食品種類至少有3種食品類型組成，每個食品類型至少測試20個樣品。

比較待確認方法與基準方法的成對結果，兩個方法的陽性結果一致則為陽性符合（PA），兩個方法陰性結果一致則為陰性符合（NA）。待確認方法檢出陽性結果，而基準方法為陰性結果，則為陽性偏離（PD）；待確認方法檢出陰性結果，而基準方法為陽性結果，則為陰性偏離（ND）。分別計算待確認方法（SEalt）和基準方法（SEref）的靈敏度，待確認方法的相對正確度（RT）和假陽性率。

其中N是樣本總數（NA + PA + PD + ND），FP是假陽性結果。

配對和非配對研究的陰性偏離（ND）和陽性偏離（PD）之差（ND - PD），配對研究的陰性偏離（ND）和陽性偏離（PD）之和（ND + PD），用于可接受性限（AL）的評估。方法確認研究的可接受性限（AL）可參考附錄A的表A.1。當結果的計算值高于AL時，則確認結果不滿足AL的要求。當AL不滿足時，應對根本原因進行分析，對觀察到的結果進行解釋。根據AL和附件信息，確認待確認方法是否不適用于所分析的食品種類或類別。

三、相對檢測水平

檢測水平（LODx）是預期可以檢測到目標微生物的最低含量。在本標準中，使用LOD50，即在一定的污染水平期望獲得50%的陽性結果。對待確認方法和基準方法的檢測水平（LOD）進行比較研究，并采用相對檢測水平（RLOD）對待確認方法進行評估。相對檢測水平的研究采用人工污染樣品的方式，在三種或更多的污染水平下進行。

RLOD定義為待確認方法和基準法的檢測水平（LOD）的比率，計算如式（5）：

配對研究的可接收性限（AL）為1.5，即待確認方法的LOD不得高于參考方法的LOD的1.5倍。未配對研究的AL設定為2.5，即待確認方法的LOD不得高于參考方法的LOD的2.5倍。待確認方法的LOD值小于基準方法的LOD值是可接受的，表明待確認方法比基準方法可能檢測到更低的污染水平。

當結果的計算值高于AL時，則確認結果不滿足AL的要求。當AL不滿足時，應對根本原因進行分析，對觀察到的結果進行解釋。根據AL和附件信息，確認待確認方法是否不適用于所分析的食品種類或類別。

四、包容性和排他性

包容性和排他性所使用的每株菌株應具有足夠詳細的生物化學和/或血清學和/或遺傳學特征。對于定量方法，包容性和排他性測試適用于特定微生物的計數（例如，李斯特氏菌），不適用于計數所有微生物總數的方法，例如菌落總數、霉菌和酵母計數等。對于包容性測試，應測試至少50個（目標）微生物純培養物。對于排他性測試，應測試至少30個（非目標）微生物的純培養物。

包容性

只需要使用待確認方法進行包容性測試，在測試過程中不需要添加樣品。測試菌株的純培養應是最佳生長條件下，非選擇性培養基上培養并處于穩定期的細胞群體。接種水平應比已確認方法的最低檢測水平高10倍至100倍。當包容性結果為陰性或可疑時，應同時用基準方法進行重復測試，分析相關菌株是否可以用基準方法進行檢測。

排他性

只需要使用待確認方法進行排他性測試，在測試過程中不需要添加樣品。測試菌株的純培養應是最佳生長條件下，非選擇性培養基上培養并處于穩定期的細胞群體。如果待確認方法具有在選擇性培養基中增菌的步驟，為了排他性測試的目的，選擇性培養基應由非選擇性培養基替代。當排他性結果為陽性或可疑時，應對待確認方法的完整測試方案進行重復測試，同時用基準方法進行測試，確認基準方法不能夠檢測出相關菌株。

五、相對正確度

相對正確度研究是對基準方法的結果與待確認方法的結果之間的比較研究。使用自然和/或人工污染樣品的方式進行。每個食品種類至少有3種食品類型組成，每個食品類型至少5個代表性樣品。所有樣品的污染水平應覆蓋微生物種類的濃度范圍。

使用Bland-Altman方法分析所獲得的結果，計算待確認方法和基準方法的平均值和差值，偏倚可以用這兩種方法測定結果的差值的平均值D進行估計，平均值D的變異情況則用差值的標準差Sd來描述。如果差值的分布服從正態分布，絕大多數差值都應位于偏差的95％置信區間內。因此，如果兩種測量結果的差異位于一致性界限內，是可以接受的。

準確度

準確度研究是通過基準方法的結果與待確認方法的結果之間的比較研究，使用人為工污染樣品的方式進行。每個測試的食品類型6個測試樣品，其中2個樣品低濃度污染水平，2個為中間水平，2個為高濃度污染水平，覆蓋所選擇的食品類型的整個污染范圍。每個測試樣品5個重復。

每個測試樣品，采用兩種方法，在重復條件下進行定量檢測。將計數結果轉換成對數，如果待確認方法的結果對數值（yi）被假定為符合正態分布，計算yi值的β期望容差區間（β-ETI）。

準確度的可接受性限設置為：AL =±0.5 log10 單位。繪制準確度分布圖形。容忍區間的上限和下限通過直線連接，以內插驗證樣本的不同水平之間的限制行為。水平線表示用基準方法獲得的參考值。參考值和待確認方法的每個污染水平的平均值的差用黑點表示。當不存在偏倚時，這些值都位于水平參考線上。此外，可接受性限由兩條水平虛線表示，β-ETI限以折線來表示。

對于所有的樣本，其β-ETI的上限值≤AL和下限值≥-AL，則認為待確認方法與基準法等效。

六、定量限LOQ

只有待確認方法的測量原理不是基于對目標微生物的菌落進行計數時，才需要確定定量限（LOQ）。例如，采用儀器法測定與微生物生長相關的電導率或熒光等。確定LOQ，需要用待確認方法測試每個食品種類的空白，相同的樣品至少測試10個測試單元，結果用于估計基線或閾值的標準偏差S0。通常建議將空白值加上10倍的重復性標準偏差作為LOQ。

七、測量不確定度

對微生物定量分析結果的不確定度產生影響的因素有很多，如質量、體積、樣品因素和非樣品因素等。其中樣品因素，如取樣（從大量的待測樣品中取出測試樣品）是總誤差的重要組成部分，但它并不是測量本身不確定度的組成部分，次級取樣是指從測試樣品（從大量樣品中取出的單元）中取出檢測的單元。例如，微生物計數中的初始懸液的制備屬于次級取樣。而非樣品因素則為分析過程（包括操作者、時間、設備、培養基和試劑等）。剩余的自由誤差的來源于以前未說明的因素，而且往往是在重復性條件下實驗室內部進行評定才需考慮的。因此，根據微生物計數的經驗，測量不確定度的評估一般不考慮偏倚。

對于微生物定量檢測的測量不確定度評估可參考RB/T 151-2016。

八、實驗室間方法研究特性參數的確認

定性方法

定性方法實驗室間確認研究的目的是確定不同實驗室人員使用相同樣品（重現性條件）進行測試時，基準方法和待確認方法之間的靈敏度差異。

實驗室間研究應至少需要10個協作實驗室的10組有效數據。樣品應由組織實驗室準備，以確保樣品之間的均一性。應使用至少三種不同的污染水平：空白對照（L0）和兩個水平（L1和L2）。至少有一個水平應獲得部分陽性的結果。理論上，1CFU/樣品的平均污染水平足以獲得部分陽性結果。每個協作實驗室需對每個污染水平，采用兩種方法，進行8個重復分析，獲得至少48個測試結果（8個重復×3個水平×2個方法）。

對于L0污染水平的結果，分別計算參考方法和替代方法的百分比特異性（SP）。

其中，N-為L0污染水平的結果數量；

P0為結果鑒定前空白對照樣品獲得的假陽性結果的數量；

CP0為空白對照樣品獲得的假陽性結果的數量。

對于L1和L2污染水平的結果，計算待確認方法的靈敏度（SEalt）和基準方法的靈敏度（SEref），相對正確度（RT）和待確認方法的假陽性率（FPR）。

配對研究中，污染水平L1或L2中至少有一個水平應獲得部分的陽性結果，計算該水平的陰性偏離（ND）和陽性偏離（PD）之差（ND - PD）和陰性偏離（ND）和陽性偏離（PD）之和（ND + PD），其其結果值不應高于可接受性限值（ALs）。不同協作實驗室數量與可接受性限（ALs）可參考附錄A的附表A.2。

非配對研究中，計算獲得部分陽性結果的水平（L1或L2）的陰性偏離（ND）和陽性偏離（PD）之差（ND - PD）。（ND-PD）的值不應高于AL。AL值定義為[（ND-PD）max]，其計算可參考ISO 16140-2 5.2.4.2。

定量方法

定量方法實驗室間研究的目的是比較不同操作者使用相同樣品在再現性條件下確認的待確認方法與基準方法的性能，并將這些結果與基準方法和待確認方法之間的可接受差異的預設標準進行比較。樣品應由組織實驗室準備，以確保樣品之間的均一性。實驗室間確證研究應有至少8個實驗室的數據，使用兩種方法對3個污染水平、每個水平2個重復樣品進行分析，得到48對數據（96個結果）。

計算結果的準確度，并繪制準確度分布圖形。容忍區間限的上限和下限通過直線連接，以內插驗證樣本的不同水平之間的限制行為。水平線表示用基準方法獲得的參考值。參考值和待確認方法的每個污染水平的平均值的差用黑點表示。當不存在偏倚時，這些值都位于水平參考線上。此外，可接受性限由兩條水平虛線表示，β-ETI限為折線來表示。

可接受性限制設置為±0.5log10單位。

對于所有污染水平，β-ETI的值位于可接受限度范圍內時，該方法被認為與基準方法相當。

方法驗證要求

總則

在微生物檢測實驗室引入標準方法時，實驗室應根據驗證操作方法是否滿足標準的要求，即證實該方法能在該實驗室現有的設施設備、人員、環境條件下獲得令人滿意的結果，必要時可參加能力驗證或進行實驗室間比對。

如果只是對標準方法稍加修改，如使用不同制造商的同類設備或試劑等，必要時也應進行驗證，以證明能夠獲得滿意的結果，并將其修改內容制訂成作業指導文件。

如果發布機構修訂了方法，應在所需的程度上重新進行驗證。

在進行方法驗證之前，應參考標準方法或已確認方法的適用范圍，選擇用于方法驗證的食品種類。

（一）定性方法

估計LOD50

選定用于方法驗證的食品種類，每個測試的食品種類需要測定3種接種水平，共8個測試。包括：2個高水平接種，接種量是不超過預期LOD50的十倍。2個中水平接種：將高水平接種物稀釋2倍得到中間水平接種物；2個低接種水平：將高水平接種物稀釋10倍得到低水平接種物。2個無接種物，作為空白對照。

高水平的接種（10×LOD50）只能獲得陽性結果。如果獲得陰性結果，則應對所有水平進行重復實驗。空白對照不應獲得陽性結果，如果獲得陽性結果，則應對所有水平進行重復實驗。

記錄每個接種水平獲得的陽性結果的數量，并使用附錄B中的表B.1確定估計的LOD50，并與方法確認研究中的LOD50進行比較。如果沒有該方法的確認資料，則估計的LOD50應該£3cfu/測試單元。

（二）定量方法

估計偏差

選定用于方法驗證的食品種類，定量方法的驗證試驗盡可能使用自然污染的樣品。樣品可以來自不同的批次（不同的產品，不同的生產商等），以覆蓋方法的測定范圍。每個驗證的食品種類需要測定3個不同批次，每個批次代表1個污染水平，3個污染水平應涵蓋該方法的使用范圍。如果樣品測試單元的預期自然污染水平低于10 cfu /g，則使用人工污染的方式。

實驗室使用基準方法（首選）或實驗室當前使用的方法，作為對照方法與待驗證方法同步進行試驗。如果實驗室沒有可同步進行的對照方法，實驗室應采用非選擇性培養基計數培養物的濃度。每個污染水平，待驗證方法的計數結果與對照方法結果之間的差值在0.5log cfu / g以內。

精密度

定量分析的精密度僅表現為實驗室內重復性。對于在重復性條件下進行的適當的測量數據，可用實驗室內重復性標準偏差（SIR）表示。

測試樣品盡可能使用自然污染的物品，如果樣品測試單元的預期自然污染水平低于10 cfu /g，則使用人工污染的方式。重復性的測定通常需要測定10個以上的測試樣品。將每個測試樣品均質化并從該均質樣品中取出兩個測試單元，定義為測試單元A和測試單元B。在驗證方法規定的范圍內，測試單元A和B的測試條件應盡量不同，應包括但不限于：a）技術人員；b）培養基和試劑；c）儀器（培養箱，渦旋混合器，移液器等）。

實驗室內重復性標準偏差（SIR）應小于或等于該方法在確認研究中給出的實驗室間再現性標準偏差（SR）。

測量不確定度

如果一個公認測試方法中對不確定度的主要影響因素貢獻值和對結果的表達方式有要求，則實驗室應該滿足于ISO/IEC 17025或同類標準的要求。

附錄A

（資料性附錄）

定性方法確認中配對和不配對研究的可接受性限參數和限值

定性方法確認中，與樣品種類數量相關的配對和不配對研究的可接受性限參數和限值，見表A.1。

表A.1 定性方法確認中配對和不配對研究的可接受性限參數和限值

注：可接受性限制（AL）基于數據和專家意見。AL不基于數據的統計分析。

實驗室間方法確認過程中，與合作實驗室數量相關的配對研究的可接受性限參數和限值，見表A.2。

表A.2 - 與合作實驗室數量相關的配對研究的可接受性限參數和限值

附錄B

（資料性附錄）

根據每個污染水平的陽性結果數量估算LOD50

根據每個污染水平的陽性結果數量估算LOD50見表B.1：

表B.1  根據每個污染水平的陽性結果數量估計LOD50