常見熒光定量PCR方法比較

SYBR Green I 檢測模式

SYBR Green I 是一種能與雙鏈 DNA 結(jié)合發(fā)光的熒光染料。其與雙鏈 DNA 結(jié)合后， 熒光大大增強(qiáng)。因此， SYBR Green I 的熒光信號強(qiáng)度與雙鏈 DNA 的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號檢測出 PCR 體系存在的雙鏈 DNA 數(shù)量。SYBR Green I 的最大吸收波長約為 497nm，發(fā)射波長最大約為 520nm。PCR 擴(kuò)增程序一般為 94℃～55℃～72℃三步法，40 個(gè)循環(huán)。SYBR Green I 的缺點(diǎn)：由于 SYBR Green I 沒有特異性，不能識別特定的雙鏈，只要是雙鏈就會結(jié)合發(fā)光，對 PCR 反應(yīng)中的非特異性擴(kuò)增或引物二聚體也會產(chǎn)生熒光，通常本底較高，所以在臨床上使用可能會有假陽性發(fā)生。

SYBR Green I 的優(yōu)點(diǎn)：SYBR Green I 的優(yōu)點(diǎn)是因?yàn)槠淙秉c(diǎn)產(chǎn)生，由于它能所有的雙鏈DNA相結(jié)合，所以對不同模板不需特別定制不同的特異性探針，通用性較好，并且價(jià)格相對較低。這對科研是很有利的，因此國內(nèi)外在科研中使用比較普遍。

SYBR GREEN I work principle

水解探針模式(Taqman探針)

TaqMan 探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的 5’末端， 而淬滅劑則在 3’末端。當(dāng)探針與靶序列配對時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與 3’端的淬滅劑接近而被淬滅。在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的 5’外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離，發(fā)射熒光。一分子的產(chǎn)物生成就伴隨著一分子的熒光信號的產(chǎn)生。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。因此 Taqman 探針檢測的是積累熒光。PCR 擴(kuò)增程序通常是：94℃～60 ℃ 40 個(gè)循環(huán)。常用的熒光基團(tuán)是 FAM，TET，VIC，HEX。

Taqman work principle

雜交探針模式(Beacon、FRET)

分子信標(biāo)是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，因此標(biāo)記在一端的熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。熒光基團(tuán)被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬滅，由熒光基團(tuán)產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為 15-30 個(gè)核苷酸長，并與目標(biāo)序列互補(bǔ);莖一般 5-7 個(gè)核苷酸長，并相互配對形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團(tuán)標(biāo)記在探針的一端，而淬滅劑則標(biāo)記在另一端。在復(fù)性溫度下，因?yàn)槟０宀淮嬖跁r(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)加熱變性會互補(bǔ)配對的莖環(huán)雙鏈解開，如果有模板存在環(huán)序列將與模板配對。與模板配對后，分子信標(biāo)將成鏈狀而非發(fā)夾狀，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開。當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時(shí)，因淬滅作用被解除，發(fā)出激發(fā)光子。由于是酶切作用的存在，分子信標(biāo)也是積累熒光。常用的熒光基團(tuán)：FAM ，Texas Red 。PCR 擴(kuò)增程序通常是：94～55～72 ℃三步法，40 個(gè)循環(huán)。

分子信標(biāo)工作原理

FRET 探針又稱雙雜交探針，F(xiàn)RET 探針由兩條相鄰探針組成，在一條探針的 5`端標(biāo)記 FAM 熒光基團(tuán)，另一探針的 3`端標(biāo)記 Red 640 熒光基團(tuán)。當(dāng)復(fù)性時(shí)，探針結(jié)合在模板上，F(xiàn)AM 基團(tuán)和 Red640 基團(tuán)相鄰，激發(fā) FAM 產(chǎn)生的熒光，作為 Red640 基團(tuán)的激發(fā)光被吸收，使 Red640發(fā)出波長為 640 的熒光。當(dāng)變性時(shí)，探針游離，兩基團(tuán)距離遠(yuǎn)，不能產(chǎn)生 640 波長的熒光。由于 FRET 探針是靠近發(fā)光，所以檢測信號是實(shí)時(shí)信號，非累積信號。常用的熒光基團(tuán)是：LC-Red640，LC-Red705。

能用于實(shí)時(shí)熒光 PCR 定量的方法很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要和當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)條件選擇適合自己的方法。下面為各種方法的比較：